Oleh: Fitriyani & Elin Helmiah

Leptospira merupakan bakteri spiral padat dengan ukuran 5-15 µm dengan ujung bengkok berkait 250 serovars patogenik yang terbagi dari 25 serogroups. Bentuk spiral, motil : salah satu ujung/dua-duanya membentuk kait. Panjang 6-20 µm, diameter 0.1 µm dan panjang gelombang 0,5 µm. Sifat bakteri negatif tetapi tidak dapat diwarnai dengan pewarna Gram harus dengan silver stain. Habitat hidup pada lingkungan dengan kelembaban tinggi dan pH netral, pada genangan air, danau dangkal, lobakan, kolam dll. Mampu bertahan hidup di alam selama beberapa bulan di air atau tanah lembab. Nutrisi baik di media EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) + enrichment rabbit serum. Noguchi(1918) memberi nama bakteri tersebut leptospira. Reservoir adalah tikus (utama), hewan ternak, kerbau, kuda, domba, kambing, babi dan anjing.
Cara penularan dengan kontak langsung dengan urine atau jaringan hewan yang terinfeksi melalui luka atau membrane mukosa. Kontak tidak langsung melalui luka yang terkena tanah, air maupun vegetasi yang terkontaminasi, menelan makanan dan minuman yang terkontaminasi. Inhalasi droplet cairan terkontaminasi juga bisa melalui manusia ke manusia walaupun jarang terjadi. Gejala leptospirosis pada manusia berupa demam tinggi, sakit kepala, menggigil, nyeri otot, mual, jaundice(kulit dan mata kuning), mata merah, nyeri perut, diare dan ruam kulit.
Pengecekan laboratorium diperlukan karena untuk memastikan diagnosis klinis karena leptospirosis memiliki gejala yang sama dengan penyakit lainnya, dan untuk epidemiologi (menentukan serovar yang menginfeksi pada lokasi tertentu) sehingga dapat digunakan untuk menentukan strategi pengendalian. Presumptive diagnosis : IgM ELISA, latex agglutination test, lateral flow, dipstick. Confirmatory diagnosis : isolasi leptospira dari darah atau material yang lain, PCR positif dari sampel darah atau serum pada awal infeksi, MAT positif (kenaikan titer 4 kali dari pemeriksaan pertama, pemeriksaan pertama dan kedua berjarak 2 minggu). Klasifikasi kasus leptospirosis pada manusia yaitu suspect : kasus leptospirosis yang memiliki gejala klinis dan positif presumptive diagnosis, confirmed : suspect yang sudah terkonfirmasi dengan Confirmatory diagnosis.
Banyak kasus leptospirosis tidak terdeteksi karena gejala yang timbul tidak spesifik mirip dengan penyakit lain seperti demam berdarah dan hepatitis, penyakit yang timbul ringan sehingga tidak terlaporkan dan pengecekan laboratorium tidak tersedia atau tes yang tersedia memiliki sensitifitas rendah pada fase awal penyakit. Deteksi leptospira dengan metode molecular berarti mendeteksi keberadaan agent/bakteri tersebut pada suatu sampel. Oleh karena merupakan deteksi agent, maka metode PCR dapat diterapkan pada semua jenis sampel. Hanya saja, terdapat hal yang harus diperhatikan jika sampel yang diperiksa merupakan sampel medis. Pada sampel darah misalnya waktu pengambilan sampel menentukan akurat/tidaknya hasil deteksi. Pada saat fase akut (fase leptospiremia), bakteri leptospira besar kemungkinan masih beredar di dalam darah, sehingga pengambilan sampel hendaknya dilakukan pada fase ini. Sebaliknya, pada fase imun, maka deteksi lebih tepat dilakukan pada sampel urine.

Pelatihan ini berguna untuk
1. mengetahui teknik pemeriksaan Microscopic Agglutination Test (MAT) pada serum tikus dan manusia
2. mengetahui teknik isolasi DNA, PCR dan elektroforesis sampel untuk deteksi leptospira pada sampel ginjal tikus dan air

Materi Pelatihan
1. Pemeriksaan leptospira menggunakan metode MAT
Tujuan : mendeteksi adanya antibodi Leptospira pada serum tikus dan manusia
Alat :
a. Plate MAT dengan dasar U
b. mikropipet
c. mikropipet multichannel 1-10 µL dan 5-50 µL
d. inkubator
e. aluminium foil
f. kaca slide
g. tisu
h. mikroskop medan gelap
i. mikroshaker
j. syringe 3 ml/5 ml
Bahan :
a. serum tikus atau manusia
b. kultur Leptospira
c. PBS 10x buffer pH 7.4
d. Alkohol 70%
Cara kerja :
a. Mikroplate disiapkan
b. Semua sumuran mikroplate diisi dengan 50 µL PBS
c. Sumuran kolom nomor 2 ditambahkan 45 µL PBS
d. Sumuran kolom nomor 2 ditambahkan 5 µL sampel serum, sehingga diperoleh pengenceran 1:20. Kemudian dicampur mengunakan mikropipet
e. Dilakukan pengenceran dengan cara mengambil 50 µL larutan pada sumuran kolom ke 2 dan dipindahkan ke sumuran kolom 3 (pengenceran 1:40). Dicampur kemudian 50 µL larutan diambil dan dipindahkan ke dalam sumuran kolom ke 4. Hal ini dilanjutkan hingga sumuran kolom 12 diperoleh pengenceran 1:5120.
f. 50 µL kultur leptospira yang digunakan dalam panel antigen kemudian ditambahkan pada semua sumuran
g. Mikroplate kemudian digoyang mengunakan mikroshaker
h. Mikroplate kemudian diinkubasi 2-4 jam pada 37°C
i. Satu tetes campuran serum dan antigen pada masing-masing sumuran diletakan pada slide, selanjutnya dilakukan pengamatan dibawah mikroskop medan gelap dengan perbesaran 200x
j. Hasil dikatakan positif apabila terjadi aglutinasi sedangkan hasil negatif apabila tidak terjadi aglutinasi atau kita melihat bakteri bebas
k. Titer sampel adalah pengenceran yang menunjukan terjadinya aglutinasi 50% jika dibandingkan kontrol

2. Pemeriksaan leptospira menggunakan metode PCR
a. Isolasi DNA
Spesimen ginjal tikus
– Cawan petri – spesimen ginjal dalam alkohol 70%
– Scalpel – aquadest steril
– Pinset – Digestion Buffer
– Pellet pastle – Proteinase K
– Pellet pastle motor – waterbath/inkubator
– Vial tube 1,5 ml – vortex
Cara kerja
– Siapkan vial tube 1,5 ml dan beri kode sampel di bagian tutupnya
– Spesimen ginjal dalam alkohol 70% dicuci dengan aquadest steril dalam cawan petri selama beberapa saat
– Spesimen ginjal dipotong melintang sampai menembus bagian korteks mengunakan pinset dan scalpel
– Ambil bagian korteks kira-kira 20-25 mg kemudian masukkan dalam vial tube 1,5 ml
– Tambahkan larutan Digestion Buffer 180 µL dan Proteinase K 20 µL
– Gerus ginjal dalam larutan menggunakan pellet pastle dan pellet pastle motor sampai hancur homegen
– Inkubasi gerusan ginjal dalam waterbath/inkubator pada suhu 55°C sambil beberapa kali di vortex, diamkan semalaman (inkubasi tergantung reagen yang dipilih)
– Sentrifuge sampel pada kecepatan pada kecepatan maksimal (18.000G) selama 2-3 menit pada suhu ruang untuk mengendapkan pellet
– Pindahkan supernatan ke vial tube baru yang steril
– Tambahkan 20 µL RNAse A, vortex dan inkubasi selama 2 menit pada suhu ruang
– Tambahkan 200 µL lysis/binding buffer, vortex
– Tambahkan 200 µL etanol 96-100%, vortex sampai larutan homogen
Sampel air
– Kertas saring Ø 0.2 µm – sampel air
– Beaker glass – RNAse A
– Gunting steril – Digestion Buffer
– Mikropipet dan tips – Proteinase K
– Etanol absolut – waterbath/inkubator
– Vial tube 1,5 ml – vortex
– Sentrifuge
Cara kerja dengan metode filtrasi
– Siapkan kertas saring dan bentuk menyerupai corong. Letakkan diatas beaker glass
– Tuangkan sampel air tepat ke tengah-tengah corong sampai sampel habis.
– Biarkan kertas saring kering angin
– Gunting-gunting bagian ujung lancip kertas saring lalu masukan ke dalam tube 1,5 ml kira-kira sampai dengan skala 0,1 ml
– Tambahkan larutan Digestion Buffer 180 µL dan Proteinase K 20 µL ke dalam tube. Vortex, pastikan kertas telah terendam sepenuhnya dalam larutan
– Inkubasi dalam waterbath/inkubator pada suhu 55°C sambil beberapa kali di vortex, diamkan 30 menit
– Sentrifuge sampel pada kecepatan pada kecepatan maksimal (18.000G) selama 2-3 menit pada suhu ruang untuk mengendapkan pellet kertas
– Pindahkan supernatan ke vial tube baru yang steril
– Tambahkan 20 µL RNAse A, vortex dan inkubasi selama 2 menit pada suhu ruang
– Tambahkan 200 µL lysis/binding buffer, vortex
– Tambahkan 200 µL etanol 96-100%, vortex sampai larutan homogen
Setelah tahap preparasi dilanjutkan dengan binding DNA, washing dan elution. Prosedur tahap tersebut sama pada semua sampel.

Kendala yang dihadapi
Untuk mendapatkan serovar kultur leptospira tidak diperjual belikan secara bebas. Dan jumlah serovar yang patogen sebanyak 25 serogrups harus dilengkapi semua untuk kevalidan hasil. Info di B2P2VRP Salatiga memiliki 15 serovar (Bangkinang, Canicola, Pyrogens, Hardjo, Djasiman, Gripphothyphosa, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Robinsoni, Bataviae, Rama, Mini, Sarmin, Manhao), yang lengkap punya 25 serovar RSU Karyadi Semarang. Bila ingin melakukan pemeriksaan MAT sebagai gold standar maka harus memiliki serovar. Perlu kerjasama dengan instansi terkait bila mau mendapatkan serovar.[fitriyani & Elin]

Tinggalkan Balasan

Alamat email Anda tidak akan dipublikasikan.